استفاده از دهانشویه اوزونه با پایه روغن زیتون برای پیشگیری از پوسیدگی: یک مطالعه اولیه آزمایشگاهی

مقدمه

ازن (O3) گازی متشکل از سه اتم اکسیژن است و ترکیبات آلی و معدنی را با اثر فوری اکسید می کند و بر غشاهای پلاسمایی باکتری ها، ویروس ها و قارچ ها نیز تأثیر می گذارد و باعث از بین رفتن آنها می شود. ازن به اشکال مختلف بر روی بافت ها اعمال می شود: مخلوط گازی از اکسیژن و ازن، آب ازن دار، یا به شکل روغن موضعی.بسیاری از مطالعات بر روی فعالیت ضد میکروبی محصولات ازن دار، با شواهدی از اثربخشی به شکل گازی، در برابر باکتری های گرم مثبت و گرم منفی، مانند Porphyromonas endodontalis و Porphyromonas gingivalis متمرکز شده اند.آب ازن دار نتایج بسیار خوبی در برابر کاندیدا آلبیکنس نشان داد و واحد تشکیل کلونی (CFU) را موثرتر از یک ضد قارچ موضعی کاهش داد. روغن ازن دار در درمان پاتولوژی های مختلف مانند بیماری های مفصلی و پوستی آزمایش شده است و در زمینه های مختلف در دندانپزشکی نیز پیشنهاد شده است: بازسازی استخوان، مینرالیزاسیون مجدد لکه های سفید، درمان مجدد کانال ریشه به دلیل پاتوژن های پایدار، ضد عفونی کردن پاکت های پریودنتال، سفید کردن، رفع حساسیت مفرط و درد مفصل گیجگاهی فکی.چندین مطالعه بالینی و آزمایشگاهی اثربخشی اوزون تراپی را در مدیریت و پیشگیری از پوسیدگی ثابت کردند. فعالیت ضد پوسیدگی اوزون در مطالعه ای توسط هلمز با هدف دستگیری و بازسازی مجدد پوسیدگی ریشه در یک کارآزمایی بالینی تصادفی ۱۸ ماهه با استفاده موضعی روزانه نشان داده شد. بایسان و لینچ اثر ازن را بر میکروبیوم دهان و پوسیدگی ریشه اولیه، با کاهش مشهود در میکروارگانیسم‌های موجود در پوسیدگی ریشه در ۵.۵ ماه پیگیری، ارزیابی کردند. از شکل گازی ازن در یک کارآزمایی بالینی برای بررسی اثر آن بر پوسیدگی شقاق اکلوزال اولیه بدون حفره در مقایسه با ضایعات کنترل طرف مقابل استفاده شد. در ۳ ماه پیگیری، نتایج نشان داد که ضایعات تحت درمان با ازن نسبت به ضایعات شاهد درمان نشده به طور قابل توجهی برگشت پوسیدگی یا کاهش پیشرفت پوسیدگی را نشان دادند. محققین به این نتیجه رسیدند که ازن گازی باعث بهبود پوسیدگی شقاق اولیه بدون حفره در بیمارانی که در معرض خطر پوسیدگی بالا قرار داشتند، طی یک دوره ۳ ماهه می‌شود.هر دو ازن گازی و آبی در مطالعات آزمایشگاهی برای ارزیابی اثربخشی آنها در مدیریت پوسیدگی مورد ارزیابی قرار گرفتند. در مطالعه ناگایوشی و همکاران نشان داده شد که آب ازن دار به شدت از تجمع پلاک های دندانی ، با اثربخشی زیادی در برابر میکروارگانیسم های دهانی گرم مثبت و منفی در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری می کند. در واقع، استرپتوکوک موتانس پس از ۱۰ ثانیه قرار گرفتن در معرض ۴ میلی گرم در لیتر آب ازن دار، به طور قابل ملاحظه ای در پلاک دندانی تجربی کاهش یافت. علاوه بر این، پلیدورو و همکاران در یک مطالعه آزمایشگاهی، اثر ضد باکتریایی ازن گازی را با اثر ضد باکتریایی آشکار بر S. mutans در هفته‌های ۴ و ۸ پیگیری ارزیابی کرد.دهانشویه های مبتنی بر روغن زیتون ازن دار در چندین مطالعه اخیر مورد آزمایش قرار گرفتند. یک مطالعه بالینی تصادفی دوسوکور و کنترل شده بسیار جدید، اثر درمانی روغن زیتون ازن دار را با سایر روش های درمانی در بیماران پریودنتیت مقایسه کرد. تیمارهای مورد تجزیه و تحلیل عبارت بودند از: درمان علّی ریشه; درمان ریشه درکنار روغن ازن. روغن ازن دار به تنهایی؛ کلرهگزیدین – استاندارد طلایی در درمان پریودنتال. نتایج نشان داد که روغن زیتون ازن دار همراه با درمان ریشه یا به تنهایی در کاهش شاخص های پریودنتال موثر است.یک بررسی سیستماتیک اخیرا وضعیت فعلی شواهد در مورد دهانشویه‌های دارای خواص ضد بیوفیلم و کاریوستاتیک را خلاصه کرده است. نتایج نشان داد که رایج ترین عوامل فعال مورد مطالعه کلرهگزیدین گلوکونات، اسانس، کلرید ستیل پیریدینیم و فلوراید (آمین فلوراید، قلع فلوراید، فلوراید سدیم، سدیم مونوفلوئوروفسفات) بودند و بر اساس شواهد، موارد حاوی فلوراید به عنوان بخشی از استراتژی پیشگیری از پوسیدگی برای افراد در معرض خطر بالای پوسیدگی توصیه شد. مطالعات انجام شده بر روی جراحی لثه مخاطی نیز نشان داد که روغن زیتون ازن دار باعث بهبودی پیوندهای بافتی می شود.تا به حال، هیچ مطالعه ای تاثیر دهانشویه مبتنی بر روغن زیتون ازن دار را بر پوسیدگی ارزیابی نکرده است، نه در مطالعه in-vivo و نه در in vitro.هدف از این مطالعه آزمایشگاهی بررسی اثربخشی روغن زیتون ازن دار در برابر عامل اصلی پوسیدگی، S. mutans بود.

۲. مواد و روشها

۲.۱. طراحی مطالعه

تجزیه و تحلیل بر اساس یک ارزیابی آزمایشگاهی با استفاده از یک طرح مطالعه که قبلا در مطالعات شرح داده شده بود و در CLSI (موسسه استانداردهای آزمایشگاهی بالینی) و در EUCAST (کمیته اروپایی برای تست حساسیت ضد میکروبی) گزارش شده بود (شکل ۱) بود.آنالیزهای میکروبیولوژیکی از طریق سه مرحله عملیاتی مختلف انجام شد: (i) ارزیابی اولیه آنتی باکتریال در صفحه آگار. (ب) اندازه گیری حداقل غلظت مهار و حداقل غلظت لازم برای اثر باکتری کش. (iii) ارزیابی فعالیت فرمولاسیون در برابر تشکیل بیوفیلم باکتریایی. دیسک افلوکساسین ۵ میکروگرم (اکسوئید) و چاه ۵۰ میکرولیتری آب به ترتیب به عنوان کنترل مثبت و منفی استفاده شد (شکل ۱).

۲.۲. دهانشویه های ازن دار با روغن زیتون و کنترل منفی

دو دهانشویه تجاری مختلف مورد آزمایش قرار گرفتند:۱- Ialozon Blu (Gemavip، Cagliari، ایتالیا)، IB، با روغن زیتون ازن دار ۲- Ialozon Rose (Gemavip، کالیاری، ایتالیا)، IR، با روغن زیتون ازن دار، اسید هیالورونیک و ویتامین E.به عنوان کنترل منفی نیز، روغن زیتون فوق اشباع (S. Giuliano، Alghero، ایتالیا) استفاده شد. تمام فرمول ها در محدوده رقت ۵۰ تا ۳.۱٪ در محلول نمکی با هدف بازتولید رقت بزاق در دهان در طول شستشوی دهان آنالیز قرار گرفتند.

۲.۳. سویه باکتریایی و تجزیه و تحلیل میکروبیولوژیکی

یک سویه از S. mutans، CIP103220 (Collection de l’Institut Pasteur) برای تست حساسیت ضد میکروبی استفاده شد.برای این بررسی آزمایشگاهی، از روش مهار کربی-بائر برای ارزیابی فعالیت ضد باکتریایی دهانشویه‌های ازن دار بر پایه روغن زیتون استفاده شد. آزمون شامل ۵ مرحله بود:

1.   تهیه محیط کشت با ۱۵ میلی لیتر محیط Schedler-agar (Microbiol, Uta, Cagliari) در دمای ۵۵ درجه سانتی گراد در ظرف پتری به قطر ۹۰ میلی متر. صفحه توسط ۱ پرچ آهنی استریل با قطر Ø ۱۰ میلی متر و ضخامت ۲ میلی متر مشخص شد که پس از انجماد آگار برداشته شد.
2. تلقیح باکتریایی استاندارد شده (۵ × ۱۰۷ CFU/mL) با استفاده از سواب استریل روی سطح صفحه کاشته شد.
3.  درج مواد مورد آزمایش: ۵۰ میکرولیتر دهان شویه Ialozon با رقت های مختلف برای هر ظرف (روغن زیتون ازن دار، Gemavip، کالیاری، ایتالیا) از طریق میکروپیپت توزیع شد.
4. برداشت از پلیت حاوی S. mutans در ۳۷ درجه سانتی گراد با ۵٪ CO2 به مدت ۲۴ ساعت.
5. پس از انکوباسیون، قطر منطقه مهار احتمالی با کولیس برای هر ظرف اندازه‌گیری شد و رقت‌های مواد مورد آزمایش که قطر منطقه بازداری را بیشتر از ۱۰ میلی‌متر را تعیین می‌کرد، ثبت شد.

حداقل غلظت بازدارنده (MIC) و حداقل غلظت باکتری کشی (MBC) با روش micro-dilution  ارزیابی شد، در حالی که حداقل غلظت بازدارنده بیوفیلم (MBIC) طبق پروتکل اصلاح شده توصیف شده توسط دانشگاه مونتانا Canter ارزیابی شد.پس از ۴۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در اتمسفر ۵ درصد CO2، صفحات با دستگاه میکروپلیت خوان در طول موج ۶۲۰ نانومتر (Multiskan FC، Thermofisher، MA، USA) خوانده شدند. MIC کمترین غلظت یک ماده ضد میکروبی بود که از رشد قابل مشاهده (عدم کدورت) جلوگیری کرد.برای تعیین MBC، ۱۰۰ میکرولیتر از رقت نشان دهنده MIC و حداقل دو فرمولاسیون غلیظ تر در Schaedler agar در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و ۵٪ CO2 قرار گرفتند. پس از ۲۴ ساعت، واحدهای تشکیل دهنده کلنی (CFUs) شمارش شدند. MBC کمترین غلظتی بود که توانست به طور موثر رشد میکروارگانیسم را کاهش دهد (۹۹.۵٪). توانایی این فرمول‌ها برای مهار تشکیل بیوفیلم طبق پروتکل رنگ‌آمیزی کریستال بنفش، همانطور که قبلا گزارش شده بود، مورد ارزیابی قرار گرفت. روش های تلقیح و رقیق سازی فرمول همان مواردی بود که قبلاً برای آزمایش های MIC و MBC شرح داده شد. در این زمینه، حداقل غلظت بازدارنده بیوفیلم (MBIC) نشان دهنده کمترین غلظتی است که می تواند با تشکیل بیوفیلم تداخل داشته باشد. به عبارت دیگر، پس از رنگ‌آمیزی بیوفیلم S. mutans با استفاده از کریستال ویولت، MBIC نشان‌دهنده غلظتی از دارو بود که می‌توانست جذبی قابل مقایسه با کنترل منفی را نشان دهد.

۲.۴. تحلیل آماری

هر آزمایش سه بار با ۳ حجم نمونه برای هر رقت تکرار شد. برای همان غلظت، تمام مقادیری که انحراف معیار (SD) را در ۱۰ ± درصد از مقدار میانگین نشان دادند، معنی دار در نظر گرفته شدند. برای مقایسه تفاوت‌های بین فرمول‌های آزمایش شده از حسابگرSocial Science Statistics (ماشین‌حساب آزمون برای ۲ میانگین مستقل) با در نظر گیری مقدار p<  ۰.۰۵ استفاده شد.

۳. نتایج

در وهله اول، به دنبال روش انتشار کربی-بائر، هر دو فرمول تجاری ، فعالیت ضد میکروبی قابل مقایسه ای را نشان دادند. میانگین قطر بازدارندگی برای ایالوزون بلو ۵/۱۶ میلی متر و برای ایالوزون رز ۱۸ میلی متر بود. تفاوت بین دو دهانشویه تجاری در قطر مهار معنی دار نبود (۰۵/0p>). در حالی که، کنترل منفی (روغن زیتون خالص) حداقل فعالیت ضد میکروبی را در برابر S. mutans نشان داد (Ø = 11 میلی متر) (شکل ۲).MIC، MBC و MBIC برای فاکتورهای رقت ۱/۳۲، ۱/۸ و ۱/۸، مربوط به ۳.۱٪، ۱۲.۵٪، ۱۲.۵٪ (درصد حجمی)، برای هر دو فرمول مشاهده شد، در حالی که روغن زیتون خالص ( شاهد) MIC، MBC و MBIC را به ترتیب ۵۰٪، >50٪، ۲۵٪ نشان دادند (شکل ۳). نتایج نشان داد که این فرمول‌ها قادر به غیرفعال کردن شکل بی‌تحرک و پلانکتونی S. mutans بودند و از اثر رقیق‌سازی اجتناب کردند. این نشان دهنده پتانسیل بالای روغن ازن دار در مقایسه با کنترل بود. در واقع با استفاده از غلظت ۵/۱۲ درصد فرموله‌های روغن ازن، ۹۹ درصد بازدارندگی رشد (MBC) مشاهده شد، در حالی که با روغن زیتون تجاری، مهار رشد به طور میانگین ۲ درصد بود( p<05/0 )شکل ۴ منحنی های بیوفیلم باقیمانده را نشان می دهد که با غلظت های مختلف محصولات روغن زیتون اوزون شده (Ialozon) و روغن زیتون خالص (شاهد) ارزیابی شده است. نمودار نشان می دهد که اثر افزودن ازن به ماتریکس روغن زیتون می تواند کاهش موثر بیوفیلم S. mutans را ایجاد کند همانطور که قبلاً با آزمایش های قبلی نشان داده شد(شکل ۱ و شکل ۲).

۴. بحث

این مطالعه آزمایشگاهی برای اولین بار اثر ضد باکتریایی دهانشویه های روغن زیتون ازن دار را بر استافیلوکوکوس موتانس ارزیابی کرد. نتایج نشان داد که هر دو فرمول آزمایش شده قادر به غیرفعال کردن S. mutans بودند، در مقایسه با یک شاهد که روغن زیتون فوق اشباع بود نشان داده شد.S. mutans یک باکتری اسید زا است که با شروع پوسیدگی در دندان های شیری و ثانویه مرتبط است.باکتری های اسید زا در سطح دندان کلونی می شوند و در حضور کربوهیدرات های قابل تخمیر باعث تخریب مینای دندان می شوند. پوسیدگی دندان در واقع به عنوان یک بیماری با علت چند عاملی تعریف می شود.پوسیدگی زایی S. mutans نتایج ذیل را به همراه دارد: (i) با چسبیدن به سطح مینا مشخص می شود. (ii) تولید متابولیت های اسیدی. (iii) ظرفیت برای ایجاد ذخایر گلیکوژن. (IV) ظرفیت سنتز پلی ساکاریدهای خارج سلولی (EPSs) .در بیماران با خطر پوسیدگی بالا، حذف مکانیکی بیوفیلم توسط روش‌های بهداشت دهان و دندان در منزل ممکن است ناکافی باشد. استفاده کمکی از عوامل ضد میکروبی به کنترل تشکیل و ترکیب پلاک از طریق موارد زیر کمک میکند: (i) کاهش سرعت کلی تجمع پلاک (۲) کاهش جزئی یا کلی پلاک موجود. (iii) ممانعت از رشد گونه‌هایی که عمدتاً به بیماری مرتبط هستند. (IV) مهار تولید EPS.تریکلوزان، زایلیتول و کلرهگزیدین در ۴۰ سال گذشته به عنوان عوامل موضعی ضد باکتری مورد استفاده قرار گرفته اند. تریکلوزان سازگاری بیولوژیکال نامطلوبی را نشان داد و در سال ۲۰۱۶ توسط سازمان غذا و داروی ایالات متحده از فرمولاسیون صابون منع شد. کلرهگزیدین امروزه استاندارد طلایی برای عوامل ضد میکروبی خوراکی موضعی است. اما استفاده طولانی مدت از آن به دلیل عوارض جانبی مانند تغییر رنگ دندان، تغییر طعم و پوسته پوسته شدن دهان توصیه نمی شود.زیست سازگاری بیولوژیکال ازن با مطالعات in-vivo و in vitro مورد ارزیابی قرار گرفت. هیچ علامت سیتوتوکسیک مشاهده نشد و ازن مایع بالاترین سازگاری زیستی را در بین آنتی سپتیک های آزمایش شده نشان داد. علاوه بر این، یک مطالعه بالینی بسیار جدید بر روی دهانشویه بر پایه روغن زیتون ازن دار مورد استفاده برای یک دوره ۳ ماهه هیچ عارضه جانبی مرتبط با مصرف روزانه آن را نشان نداد.مطالعه حاضر داده‌های جدیدی را در مورد اثربخشی فرمول‌های خوراکی مبتنی بر ازن علیه پاتوژن اصلی پوسیدگی دندان ارائه می‌کند. مقاله مروری قبلی در مورد ازن درمانی با هدف ارزیابی اثربخشی آن در مدیریت و پیشگیری از پوسیدگی انجام شد. این مطالعه آزمایشگاهی فعلی برای اولین بار اثر ضد میکروبی دو دهانشویه مبتنی بر روغن زیتون ازن دار را ارزیابی کرد. هر دو فرمول فعالیت ضد میکروبی قابل مقایسه ای را نشان دادند. MIC، MBC، و MBIC برای غلظت حجمی ۳.۱٪، ۱۲.۵٪، ۱۲.۵٪ مشاهده شد. سرعت کاهش بیوفیلم، همانطور که در شکل ۴ نشان داده شده است، با استفاده از روغن زیتون ازنیزه شده در مقایسه با کنترل بیشتر بود. همچنین، نتایج نشان داد که با افزایش غلظت درصد محصول ازنیزه شده، اثربخشی بر کاهش بیوفیلم نسبت به کنترل،  سه برابر بیشتر بود. نتایج حاضر نشان داد که این فرمول‌ها قادر به غیرفعال کردن شکل بی‌تحرک و پلانکتون S. mutans بودند. استافیلوکوکوس موتانس اغلب با پلاک دندانی همراه است و کلونی های میکروبی بسیار سازمان یافته را تشکیل می دهد. توانایی تشکیل بیوفیلم به عنوان یکی از عوامل بیماریزای استرپتوکوک موتانس از جمله S. mutans در نظر گرفته شده است.علاوه بر این، مقایسه دو فرمولاسیون روغن تجاری ازنیزه شده تفاوت معنی داری را نشان ندادند. در واقع، وجود اسید هیالورونیک و ویتامین E در محصول ایالوزون رز قادر به ایجاد فعالیت ضد باکتریایی بیشتری نبود. این رفتار را می توان بر اساس غلظت ناکافی این عوامل یا واکنش اکسیداتیو غیرمنتظره این ترکیبات با ازن توضیح داد. برای بررسی این نتیجه آزمایشات بیشتری لازم است.نتیجه مطالعه حاضر مطابق با انتشارات قبلی در مورد فعالیت ازن در برابر باکتری های گرم مثبت است. وانگ و همکاران ارزیابی کردند که اثر مهاری S. mutans به غلظت ازن و طول زمان درمان بستگی دارد. به عنوان مثال ۲.۷۳ میلی گرم در لیتر ازن در آب به مدت ۴۵ دقیقه توانست این پاتوژن را از بین ببرد.Ialozon Blu یک دهانشویه با روغن زیتون ازن دار است، در حالی که Ialozon Rose در روغن زیتون ازن دار به علاوه ی اسید هیالورونیک و ویتامین E است. روغن زیتون یک عنصر اصلی رژیم غذایی مدیترانه ای است و غنی از اسید اولئیک و ترکیبات فنولیک میباشد.نشان داده شد که روغن زیتون برای افزایش مهار فلوراید، تشکیل پلی ساکارید خارج سلولی (EPS) توسط S. mutans و جلوگیری از تشکیل بیوفیلم مفید است. بنابراین، روغن زیتون، به عنوان یک عنصر واحد، ممکن است در راستتای ارتقای سلامت دهان و دندان هم در پیشگیری از پوسیدگی دندان و هم در پیشگیری از پریودنتیت مفید باشدعلاوه بر این، مطالعه قبلی ازن موضعی را به عنوان یک عامل موثر در بازسازی مینای دندان مشخص کرد. یک مطالعه اخیر فعالیت ضد باکتریایی بر علیه استافیلوکوکوس موتانس را به واسطه آب ازن دار با ۲۰/۰ درصد کلرهگزیدین مقایسه کرد. این مطالعه شامل ۴۶ بیمار کودک بود که به دو گروه تقسیم شدند و همه آنها با غلظت داخل دهانی S. mutans بیشتر از ۱۰۵ CFU، که در ابتدا با نمونه‌های بزاق ارزیابی شدند، بودند. پس از ۱۴ روز مصرف روزانه کلرهگزیدین و دهانشویه آب ازن دار، سطح CFU در هر دو گروه کاهش یافت، اما در گروه با آب ازن دار کاهش چشمگیر تر بود.با این حال، تا به امروز، هیچ مطالعه ای روغن زیتون ازن دار را علیه S. mutans آزمایش نکرده بوده است. مطالعه آزمایشگاهی کنونی شواهد جدیدی در مورد اثربخشی دهانشویه‌های روغن زیتون ازن دار در برابر پاتوژن اصلی پوسیدگی دندان ارائه می‌کند. پوسیدگی دندان یک فرآیند چند عاملی است و پیشگیری بسیار مهم است. در کودکان و بزرگسالان، رعایت مسواک زدن و روش های بهداشت دهان و دندان در خانه ممکن است به صورت روزانه دشوار باشد. استفاده از دهانشویه های جدید روغن زیتون ازن دار می تواند یک ابزار پیشگیرانه برای روش های بهداشت دهان و دندان در خانه باشد.تحقیقات بیشتری برای ارزیابی کارایی دهانشویه‌های مبتنی بر روغن زیتون ازن دار بر علیه استافیلوکوکوس موتانس توسط مطالعات بالینی in vitro و in-vivo در کودکان و جمعیت‌های بزرگسال پرخطر و در افراد دارای تنفس دهانی که نیاز به درمان ارتودنسی دارند، مورد نیاز است.

۵. نتیجه گیری ها

در نتیجه، این مطالعه فعالیت ضدباکتریایی و آنتی بیوفیلمی را بر علیه S. Mutans توسط دو فرمول حاوی روغن زیتون ازن دار نشان داد. این مطالعه ایمنی این دهانشویه ها را برای استفاده روزانه نشان داد ،اگرچه داده های بیشتری در مورد اثربخشی آنها مورد نیاز است.