مطالعه مقدماتی بر روی اثر روغن ازن دار موضعی در مدیریت درمانی درماتیت آتوپیک در افراد در حال درمان

معرفی

درماتیت آتوپیک (AD) یک بیماری پوستی است که به شکل التهاب مزمن شایع و عود کننده مشخص می شود. این بیماری ضایعات پوستی اگزماتوز و خارش شدید را از خود نشان می دهد و ۳۰-۱۰ درصد از کودکان و ۱۰-۲ درصد بزرگسالان را متناسب با جمعیت درگیر می کند. عوامل ژنتیکی، ایمونولوژیکی و محیطی عوامل اصلی ایجاد التهابات پوستی در AD  هستند. بیماران مبتلا به AD حساسیت بیشتری نسبت به عفونت یا کلونیزاسیون با باکتری ها، قارچ ها و ویروس ها، به ویژه استافیلوکوکوس اورئوس دارند که منجر به ایجاد و تشدید علائم اگزماتوز می شود . به طور کلی، قرار گرفتن در معرض مداوم پاتوژن‌ها پاسخ‌های ایمنی مناسب را ایجاد می‌کند و باعث ایجاد محیط تخصصی T helper (Th)2-biascytokine می‌شود. کورتیکواستروئیدهای موضعی (TCS) و مهارکننده های کلسینئورین خط اول درمان برای AD هستند. با این حال، آنها می توانند با عوارض جانبی قابل توجهی برای کاربردهای مزمن همراه باشند. درمان‌های تعدیل‌کننده ایمنی سیستمیک برای AD در حال توسعه هستند که اوزون مثالی برای این مساله میباشد. O3 به طور گسترده ای به عنوان یکی از عوامل رایج باکتری کش، ضد ویروسی و ضد قارچی شناخته شده است. اوزون به طور تجربی برای درمان زخم های مزمن، مانند زخم های تروفیک، زخم های ایسکمیک و زخم های دیابتی استفاده شده است. مکانیسم‌های احتمالی ، کاهش عفونت باکتریایی، بهبود اختلال در ترمیم زخم پوستی یا افزایش استرس اکسیداتیو در ناحیه زخم هستند. همچنین ما دریافتیم که آب ازن دار می تواند به طور موثر MRSA را از بین ببرد و هر دو مورد MRSA با ازن درمانی به طور کامل بهبود یافته اند. در این مطالعه، ما تلاش کردیم تا بررسی کنیم که آیا تجویز ازن می‌تواند یک درمان بالقوه برای AD از طریق تنظیم ایمنی و اثر ضد عفونت آن باشد یا خیر.

مواد و روشها

حیوانات و مواد

این تحقیق مطابق با اعلامیه هلسینکی و راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی که توسط مؤسسه ملی بهداشت ایالات متحده تصویب و منتشر شده است، انجام شد. تمام پروتکل‌های آزمایشی توسط کمیته بازبینی برای استفاده از افراد انسانی یا حیوانی در بیمارستان سوم Xiangya، دانشگاه مرکزی جنوبی تأیید شد. روغن ازن دار با مقدار پراکسید ۲۰۰۰ تا ۲۲۰۰mmol-equiv/Kg و حامل آن، روغن کاملیا، توسط شرکت Hunan Health CareTechnology LTD (هونان، چین) ارائه شد. اووالبومین (OVA) و استافیلوکوکالنتروتوکسین B (SEB) از سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) و محلول سالین بافر فسفات استریل شده (PBS) بودند. پماد کلسیپوتریول (CO) و کرم موبر از شرکت داروسازی لئو خریداری شده است.

در این مطالعه از هجده افراد در حال درمان ماده ۶ تا ۸ هفته‌ای BALB/c استفاده شد. حیوانات با تزریق داخل صفاقی هیدرات کلرال بیهوش شدند. موهای پشت افراد در حال درمان با استفاده از کرم موبر حذف شد. یک شکاف پچ کوچک، حاوی ۱۰۰ میکرولیتر PBS، یا مخلوطی از ۱.۲۵ میکروگرم SEB، ۵۰ میکروگرم OVA و ۱۰ میلی گرم CO، به ترتیب با یک پانسمان در ناحیه تراشیده شده پوست اعمال شد. داروها به طور مکرر یک روز در میان به مدت ۱۵ روز استفاده شدند (شکل ۱). همانطور که در شکل ۱ نشان داده شده است، در روز شانزدهم، افراد در حال درمان به چالش کشیده شده روزانه به مدت یک هفته تحت درمان با روغن ازن دار قرار گرفتند. غلظت روغن ازن دار ۰.۱ml/cm2 بود. در گروه کنترل، افراد در حال درمان با PBS یا روغن حامل بدون ازن‌ تحت درمان قرار گرفتند. در روز ۲۳، نمونه‌های پوست با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال بازتابی (RCM) برای اندازه‌گیری ضخامت اپیدرم تحت بیهوشی اسکن شدند. بافت‌های پوست برداشته شدند و در ۱۰% فرمالدئید خنثی بافر و تعبیه شده در پارافین ثابت شدند. مقاطع با ضخامت ۴ میکرومتر و سپس با رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) برش داده شدند.

Real-time PCR برای تعیین سطوح mRNA سیتوکین ها، از جمله IL-4، IL-31، IL-2، TNF-α، IFN-γ، IL-10 و NGF، در پوست استفاده شد. مجموع RNA های هر ضایعه با استفاده از معرف TRIZol (Invitrogen) طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. سپس DNA مکمل از یک میکروگرم توتال RNA با استفاده از هگزامر تصادفی و ترانس کریپتاز معکوس MMLV (Thermo Scientific) سنتز شد. تکثیر cDNA با استفاده از کیت SYBR Green Master Mix طبق پروتکل سازنده انجام شد. ژن‌های هدف با استفاده از پرایمر اختصاصی الیگونوکلئوتیدی تکثیر شدند و از ژن β-اکتین به عنوان کنترل درون‌زا استفاده شد (جدول ۱). داده‌ها با استفاده از روش مقایسه‌ای Ct (2-∆∆Ct) تجزیه و تحلیل شدند. سه آزمایش جداگانه برای هر ضایعه انجام شد.

نتایج

روغن ازن دار التهاب آلرژیک پوست را سرکوب می کند

در مدل افراد در حال درمان BALB/c AD بر اساس شماتیک (شکل ۱) ضایعات پوستی به صورت اریتم، ندول‌های زیر جلدی، اریتم نفوذی و زخم در محل‌های حساسیت اپی‌جلدی با آلرژن‌های تریپلکس OVA، SEB و CO ظاهر شد. ضایعات به مدت یک هفته مورد درمان با روغن اوزون‌شده قرار گرفت که نهایتا تورم و اریتم در مقایسه با محل‌های تحت درمان با PBS کاهش یافت. (شکل ۲ a). در محل‌های پوستی تحت درمان با روغن اوزون شده لایه پوستی حاوی تعداد سلول‌های هسته‌دار کمتری در مقایسه با محل‌هایی است که با PBS درمان شده‌اند (شکل ۲b). ضخامت لایه اپیدرمی در محل‌های تیمار شده با روغن ازن دار به طور قابل توجهی کمتر از مکان‌های تیمار شده با وکتور بود. از آنجایی که NGF (فاکتور رشد عصبی) یک نشانگر برای شدت AD است ما پروفایل بیان NGF را تجزیه و تحلیل کردیم. تیمار روغن ازن به طور قابل توجهی سطح بیان NGF را کاهش داد و به طور کلی این یافته ها نشان داد که روغن ازن دار التهاب پوستی آلرژیک را مهار کرده و بهبود ضایعات را در ۷ روز بهبود می بخشد.

روغن ازن دار بیان سیتوکین های Th2 را در پوست و سرم آلرژیک مهار می کند

سطوح mRNA سیتوکین‌های Th2، IL-4 و IL-31، در پوست‌های حساس تحت درمان با PBS یا Vehicle به شدت بیان شد (شکل ۳a، ۳b). mRNA های IL-4 و IL-31 به طور قابل توجهی پس از تیمار روغن ازن دار در مقایسه با PBS کاهش یافت (P<0.05). به طور مشابه، مداخله روغن ازن دار منجر به کاهش قابل توجهی در سیتوکین های Th2 سرم شد (شکل ۳d، ۳e) (P<0.05). تفاوت معنی داری بین گروه PBS و گروه تحت درمان با حامل وجود نداشت.

روغن ازن دار رونوشت سیتوکین های Th1 را در محل ضایعه مهار می کند اما سطح پروتئین را در سرم مهار نمی کند.

سطوح پروتئین مشابهی از سیتوکین های نوع Th1 سرم شامل TNF-α (شکل ۳f) و IFN-γ (شکل ۳j) در بین هر سه گروه نشان داده شد. با این حال، سطوح mRNA TNF-α، IFN-γ و IL-2 در پوست آتوپیک تحت درمان با روغن ازن دار در مقایسه با PBS یا پوست آتوپیک درمان شده با حامل به طور قابل توجهی کمتر بود (شکل ۳c، ۳g، ۳h، p<0.05).

روغن ازن دار بیان سیتوکین سرکوب کننده سیستم ایمنی IL-10 را افزایش داد

ما بعداً بررسی می کنیم که آیا درمان روغن ازن دار با بیان سیتوکین IL-10 مرتبط است یا خیر. سطح mRNA IL-10 در گروه تیمار شده با روغن ازن دار در مقایسه با PBS و پوست های آتوپیک تیمار شده با حامل به طور قابل توجهی بالاتر بود (شکل ۳i، p<0.01). تفاوت معنی داری بین سطوح IL-10 بین دو گروه کنترل وجود نداشت (شکل ۳i، ۳l).

بحث

 ویژگی های بارز AD ضایعات پوستی اگزماتوز و خارش شدید است. مطالعات اخیر نقش سیستم عصبی را در پاتوژنز AD مورد بررسی قرار داده است. پیشنهاد شده است که NGF به عنوان نشانگر زیستی شدت بیماری AD عمل میکند. علاوه بر این، روغن ازن دار می تواند بیان NGF را در سرم و پوست آتوپیک کاهش دهد که نشان دهنده عملکرد آن در بهبود شدت بیماری است. ازون به صورت موضعی برای درمان زخم های جنگی، عفونت های بی هوازی، عفونت های تبخال، زخم ها و سوختگی های تروفیک، سلولیت، آبسه، شقاق مقعدی و  ورم لثه استفاده می شود. هی و همکاران گزارش دادند که استفاده از روغن ازن دار می تواند ترمیم زخم پوستی حاد را در مدل خوکچه هندی با افزایش سنتز کلاژن و تکثیر فیبروبلاست در محل آسیب و با افزایش بیان فاکتورهای رشد مانند PDGF، TGF-β، و VEGF تسریع کند. در مشاهدات ما، آب ازن نیز می تواند عفونت MRSA پوست را بهبود بخشد. علاوه بر این، ازن می‌تواند بر بیان سیتوکین‌های ضد التهابی مورد پذیرش، مانند IL-1 و TNF-α، و پاسخ‌های التهابی تطبیقی از جمله فعال‌سازی ژن COX-2 در کراتینوسیت از طریق فعال‌سازی NFκB تأثیر بگذارد. این یافته‌ها نشان می‌دهد که ازن می‌تواند تکثیر و تمایز کراتینوسیت هایی را که بر بیولوژی پوست تأثیر می گذارند القا کند. با این حال، روغن ازن دار از طریق غشاهای مخاطی نفوذ نمی کند و روی گیرنده های خاصی اثر نمی گذارد و عمل آن غیر مستقیم است. O3 به سرعت با آنتی اکسیدان ها و اسیدهای چرب غیراشباع چندگانه (PUFA) واکنش می دهد و در نتیجه پیام های ثانویه درون سلولی مانند هیدروژن پراکسید (H2O2) و ۴-hydroxynonenal تشکیل می شود. این پیام رسان های ثانویه در نهایت عوامل رونویسی هسته ای، مانند NFκB، فاکتور هسته ای سلول های T فعال (NFAT)، پروتئین-۱ فعال (AP-1)، و همچنین تعدیل بیشتر اینترفرون ها و سیتوکین ها را فعال می کنند. مطالعه حاضر نشان می دهد که روغن ازن دار در عرض یک هفته، احتمالاً از طریق پیام ثانویه H2O2، ضایعات پوستی را به سرعت بهبود می بخشد. با این حال، مکانیسم دقیق ناشناخته است. افزایش از دست دادن آب باعث خشک شدن پوست و ایجاد التهاب با شروع یک آبشار سیتوکین می شود. افزایش ورود آلرژن ها و محرک ها همچنین باعث می شود پوست آتوپیک بیشتر مستعد ابتلا به درماتیت تماسی تحریک کننده باشد. مرطوب کننده ها می توانند عملکرد سد معیوب مرتبط با AD را از طریق مکانیسم های متعدد بهبود بخشند. به عنوان مثال، آنها خطرات ترک خوردگی را با افزایش هیدراتاسیون پوست، تسکین خارش و اعمال اثرات ضد میکروبی و ضد التهابی کاهش می دهند. بنابراین، حتی حامل، روغن کاملیا، مورد استفاده در مطالعه حاضر نیز می تواند به بهبود AD کمک کند. پاسخ‌های Th2 منجر به افزایش تولید سیتوکین‌ها، در درجه اول IL-4 و IL-31 می‌شود، که سپس آسیب‌شناسی AD را ایجاد می‌کند. در مطالعه حاضر، ما نشان دادیم که روغن ازن دار به طور بالقوه پاسخ Th2 را در مدل AD مهار می کند. از طرف دیگر، سطح سیتوکین های سرم توسط روغن ازن دار تنظیم نمی شود، اما سطوح mRNA آنها در پوست آتوپیک درمان شده با روغن ازن دار مهار می شود. این نتایج اجازه می‌دهد که فرض کنیم که پوست ضایعه‌ای که یک الگوی سیتوکین التهابی مختلط را نشان می‌دهد ممکن است نتیجه خود ایمنی و عفونت ثانویه باشد. دلیل ناهماهنگی بین سطوح mRNA سیتوکین Th1 در سطح پوست ضایعه و پروتئین در سرم ناشناخته است و در دست بررسی های بیشتر است. Tregs ترجیحاً سیتوکین های سرکوب کننده ایمنی حیاتی TGF-β۱، IL-10، و IL-35 را بیان می کنند. کاهش جذب Tregs به پوست با التهاب شدید و تکثیر کراتینوسیت همراه است. بنابراین، یافته‌های ما نشان می‌دهد که ازن می‌تواند به طور بالقوه به تنظیم پاسخ‌های ایمنی در مدل AD از طریق القای بیان IL-10 کمک کند. در نتیجه، نتایج حاضر نشان داده است که روغن ازن دار می تواند به طور موثری پوست آتوپیک را از طریق بازیابی تعادل Th1/Th2 و افزایش بیان سیتوکین IL10 بهبود بخشد. نتایج ما نشان می دهد که روغن ازن دار می تواند به طور بالقوه یک استراتژی درمانی جدید برای درمان AD باشد.